帕金森病大鼠模型学习记忆能力与左旋多巴的关系

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.07.015

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (7): 1069-1075.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.07.015

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帕金森病大鼠模型学习记忆能力与左旋多巴的关系

邢红霞¹，袁燕¹，刘胜²，殷闯³，韩金红⁴，周慧聪⁵，苏洲¹，郭双喜¹，王玉梅¹

新乡医学院第一附属医院，¹神经内一科， ²新普外二科，⁵消化内科，河南省卫辉市 453100；³新乡医学院第三附属医院神经内科，河南省新乡市 453003；⁴新乡医学院基础医学院组织与胚胎教研室，河南省新乡市 453003

修回日期:2013-12-06 出版日期:2014-02-12 发布日期:2014-02-12
通讯作者: 王玉梅，硕士，主任医师，新乡医学院第一附属医院神经内一科，河南省卫辉市 453100
作者简介:邢红霞，女，1972年生，河南省人，2013年郑州大学毕业，博士，副主任医师，主要从事神经变性性疾病、脑血管病基础及临床研究。
基金资助:
2006年新乡医学院立项资助项目

Relationship between learning and memory capacities and levodopa in rat models of Parkinson’s disease

Xing Hong-xia¹, Yuan Yan¹, Liu Sheng², Yin Chuang³, Han Jin-hong⁴, Zhou Hui-cong⁵, Su Zhou¹, Guo Shuang-xi¹, Wang Yu-mei¹

¹First Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China; ²Second Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China; ³Department of Neurology, Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China; ⁴Department of Histology and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China; ⁵Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China

Revised:2013-12-06 Online:2014-02-12 Published:2014-02-12
Contact: Wang Yu-mei, Master, Chief physician, First Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China
About author:Xing Hong-xia, M.D., Associate chief physician, First Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China
Supported by:
the Xinxiang Medical University Project in 2006

摘要/Abstract

摘要：

背景：帕金森病治疗的经典药物是左旋多巴，但是长期应用会产生异动症等并发症。
目的：观察左旋多巴对帕金森病模型大鼠学习记忆能力的影响，并探讨其机制。
方法：应用6-羟多巴胺制作帕金森病大鼠模型。将228只造模成功的帕金森病大鼠分为对照组和实验组，实验组大鼠分别按10，20，30 mg/(kg•d)腹腔注射左旋多巴，连续28 d，然后分别于腹腔注射后1，3，5，7，14，28 d测定其学习记忆能力及血浆同型半胱氨酸和叶酸水平。测定大鼠海马区乙酰胆碱酯酶活性，并应用Bielschowsky染色观察海马神经原纤维缠结。
结果与结论：随左旋多巴剂量增大、应用时间延长，可明显降低大鼠学习记忆能力(P < 0.001)；升高血浆同型半胱氨酸水平，降低叶酸水平(P < 0.001)；降低大鼠海马区乙酰胆碱酯酶活性(P < 0.001)；增多大鼠海马区神经原纤维缠结(P=0.000)。提示大量使用左旋多巴可造成帕金森病模型大鼠学习记忆能力明显下降，引起海马区乙酰胆碱酯酶活性下降，促进海马区神经原纤维缠结增多，其机制可能与升高同型半胱氨酸有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 左旋多巴, 帕金森病, 学习记忆, 乙酰胆碱酯酶, 神经原纤维缠结, 同型半胱氨酸, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Classical drug for Parkinson’s disease is levodopa, but long-term application of levodopa can induce complications such as dyskinesias.
OBJECTIVE: To observe the effects of levodopa on learning and memory capacities of Parkinson’s disease rats and to study its mechanisms.
METHODS: The rat models of Parkinson’s disease were established using 6-hydroxydopamine. The 228 model rats were randomly divided into control group and experimental group. Rats in the experimental group were intraperitoneally injected with 10, 20 and 30 mg/(kg•d) levodopa for 28 consecutive days. At 1, 3, 5, 7, 14 and 28 days after intraperitoneal injection, we observed the rats’ learning and memory capacities and tested plasma concentration of homocysteine and folic acid. Acetylcholinesterase activities in the rat hippocampus were measured. Hippocampal neurofibrillary tangles were observed using Bielschowsky staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Increased dose of levodopa and prolonged application time obviously decreased learning and memory capacities in rats (P < 0.001), increased plasma homocysteine levels, reduced folic acid levels (P < 0.001), diminished acetylcholine esterase activities in the rat hippocampus (P < 0.001), and increased neurofibrillary tangles in the rat hippocampus (P=0.000). Results suggested that a large dose of levodopa could significantly decrease the learning and memory capacities, and disease acetylcholine esterase activities, and increase neurofibrillary tangles in hippocampus. Its mechanism possibly associated with the increased plasma concentration of homocysteine.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: levodopa, Parkinson’s disease, learning, acetylcholine esterase, homocysteine

中图分类号:

R318

邢红霞，袁燕，刘胜，殷闯，韩金红，周慧聪，苏洲，郭双喜，王玉梅 . 帕金森病大鼠模型学习记忆能力与左旋多巴的关系[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(7): 1069-1075.

Xing Hong-xia, Yuan Yan, Liu Sheng, Yin Chuang, Han Jin-hong, Zhou Hui-cong, Su Zhou, Guo Shuang-xi, Wang Yu-mei. Relationship between learning and memory capacities and levodopa in rat models of Parkinson’s disease [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(7): 1069-1075.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 纳入228只帕金森病模型大鼠，分为对照组(n=12)和左旋多巴10，20，30 mg/(kg•d)组(n=72)。学习能力测试后左旋多巴10，20，30 mg/(kg•d)组每组剩余48只大鼠进入实验。

2.2 学习、记忆能力 在各时间点左旋多巴10 mg/(kg•d)组大鼠的学习能力与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，而左旋多巴20 mg/(kg•d)及30 mg/(kg•d)组在各时间点学习能力与对照组比较差异有显著性意义(F=100.160，P < 0.01)；与其他时间点组相比，左旋多巴20 mg/(kg•d)组及30 mg/(kg•d)组第14天及第28天的学习能力明显降低(F=66.951，P < 0.01)；大鼠学习能力随左旋多巴剂量增大、应用时间延长明显下降(时间*分组交叉效应F=25.133，P=0.000，表1)。与学习能力结果相似，大鼠记忆能力随左旋多巴剂量加大、应用时间增加明显下降。由此得出结论，随左旋多巴剂量加大、应用时间延长可导致大鼠学习、记忆能力明显下降(P < 0.01，表1)。

2.3 总同型半胱氨酸和叶酸水平 与对照组相比，在各时间点左旋多巴10 mg/(kg•d)组总同型半胱氨酸水平差异无显著性意义(P > 0.05)，而在各时间点左旋多巴 20 mg/(kg•d)组及30 mg/(kg•d)组总同型半胱氨酸水平与对照组比较差异有显著性意义(F=7 194.581，P=0.000)；于第28天左旋多巴20 mg/(kg•d)组总同型半胱氨酸水平较之前其他时间点显著增高，在左旋多巴30 mg/(kg•d)组中随时间增加，总同型半胱氨酸水平亦有增高的趋势(F=331.023，P=0.000)，说明大鼠血浆总同型半胱氨酸水平随着左旋多巴剂量的增大、应用时间的增加明显升高(时间*分组交叉效应F=437.890，P=0.000，表2)。同样在实验中叶酸水平随着左旋多巴剂量的增大、应用时间的增加明显降低(P < 0.001，表2)。

2.4 乙酰胆碱酯酶活性测定 与对照组相比，各时间点左旋多巴10 mg/(kg•d)组乙酰胆碱酯酶活性差异无显著性意义(P > 0.05)，而左旋多巴20 mg/(kg•d)组及 30 mg/(kg•d)组于各时间点乙酰胆碱酯酶活性较对照组降低(F=132.543，P=0.000)。在第7，14及28天，左旋多巴20 mg/(kg•d)组及30 mg/(kg•d)组乙酰胆碱酯酶活性较其他时间点降低(F=2.265，P=0.026)。大鼠乙酰胆碱酯酶活性随左旋多巴剂量增大、应用时间增加明显下降(时间*分组交叉效应：F=2.016，P=0.020，表3)。

2.5 神经原纤维缠结观察 左旋多巴10 mg/(kg•d)组各时间点神经元排列整齐、密集，胞体呈圆球形，神经元未见拖尾且染色较深的轴突；与对照组比无显著差异(P > 0.05)。左旋多巴20 mg/(kg•d)组及30 mg/(kg•d)组各时间点神经元的形态有较大改变，神经元排列散乱，细胞内神经原纤维增粗，排列紊乱，可在CA1区见到较多胞体染色较深的神经元并呈拖尾状的深染的轴突斑块，形成神经原纤维缠结(黑色箭头)。可导致大鼠神经原纤维缠结样改变的神经元数量随左旋多巴剂量增大、应用时间增加显著增多(时间*分组交叉效应：F=161 264.562，P=0.000，表4及图1)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2006年12月至2009年2月在新乡医学院基础医学院完成。

材料：
实验动物：成年普通级Wistar大鼠，体质量180-250 g，雌雄不限，自由饮食且将维生素B12和叶酸的摄入量控制正常水平，由郑州大学医学院实验动物中心提供，许可证号：SYXK(豫)2007-0009。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

方法：

模型制备及分组：应用改良的Thomas等^[7]方法制作出帕金森病大鼠模型，于右侧黑质致密部及中脑腹侧背盖区注射含有0.27%维生素C的6-羟多巴胺(0.2%)5 μL。于 6-羟多巴胺注射前1 d及后2周，所有造模大鼠在40 cm× 50 cm的塑料箱中(箱底覆盖薄层锯沫)，腹腔注射阿朴吗啡0.5 mg/kg(0.1 g/L)。诱发旋转，观察每组旋转数目，排除自发旋转的动物。以旋转圈数大于7 r/min的大鼠作为成功帕金森病大鼠模型。最后共有228只成功的帕金森病大鼠模型。

造模成功的大鼠按随机数字表法分为对照组(n=12)和左旋多巴 10，20，30 mg/(kg•d)组(n=72)。不同剂量实验组大鼠腹腔注射阿朴吗啡后3 d，每天于9：00和19：00分2次腹腔注射左旋多巴，用量分别按体质量10，20， 30 mg/kg计算，连续28 d。对照组大鼠以相同方法注射等量生理盐水。

学习、记忆能力检测：将各实验组大鼠随机分为6个亚组(n=12)，分别于第1，3，5，7，14和28天进行Y型电迷宫测试，电压设为40 V，采用不固定次数随机法(即安全区以无规则的次序变换)^[8]。学习能力：大鼠先静置于起步区 3 min，给以电击，大鼠逃至安全区，灯光持续15 s后熄灯休息，45 s后再开始下一次操作。连续 10 次试验有 9 次正确为达到学会标准，学不会的大鼠淘汰，最后每个实验组剩余48只实验大鼠，记录达标所需训练次数。记忆能力：24 h 后以同样方法测试大鼠记忆保存情况。

血浆总同型半胱氨酸和叶酸水平测定：Y型电迷宫测试后的大鼠于采血前1 d禁食。以40 mg/kg腹腔注射质量浓度1%戊巴比妥钠的标准麻醉，后从心脏采血，肝素抗凝，分离血浆，-20 ℃冰箱保存待测。应用高效液相色谱仪测定血浆同型半胱氨酸及叶酸水平，荧光检测条件：激发波长385 nm，放射波长515 nm^[9]。采用C18反相柱和50 mmol/L KCl流动相，30 min洗脱时间，0.5 mL/min的流速。

灌注取材：Y型电迷宫试验结束并采血后，麻醉大鼠，左心室插入导管，快速灌入生理盐水100 mL，继而40 g/L多聚甲醛400 mL在2 h内灌入，断头取脑，40 g/L多聚甲醛浸泡固定。取左侧海马组织行乙酰胆碱酯酶活性测定，右侧海马前后约3 mm厚标本，经脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋后进行冠状位切片，片厚5 μm。

乙酰胆碱酯酶活性测定：将左侧海马用冰生理盐水冲洗，除去血液，滤纸吸干，电子天平称质量。在冰浴下用玻璃匀浆器制备10%的组织匀浆，用比色法测定脑组织中乙酰胆碱酯酶的活性，所有操作严格按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行^[10]。

改良的Bielschowsky染色：右侧海马组织制成的石蜡切片脱蜡至水，放入预先加热至37 ℃的20%硝酸银溶液内30 min，蒸馏水速洗，入体积分数10%中性甲醛液还原 20 s，Marsland氏银氨溶液中作用30 s，取出切片去除多余的银溶液，再入体积分数10%中性甲醛液还原1 min，蒸馏水冲洗，入5%硫代硫酸钠水溶液中作用约5 min，常规脱水、透明，中性树胶封固，AX70 OLYMPUS光学显微镜观察，银染色处呈黑色，背景呈黄色^[11]。

主要观察指标：①各组大鼠的学习、记忆能力。②各组大鼠不同时间点血浆同型半胱氨酸和叶酸水平。③各组大鼠不同时间点乙酰胆碱酯酶活性测定。④各组神经原纤维缠结观察。

统计学分析：由第二作者运用SPSS 17.0软件进行统计学分析，采用两因素多水平重复测量的方差分析，数据以x(_)±s表示，以α=0.05为显著性水准。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

从20世纪60年代至今治疗帕金森病最有效的药物仍为左旋多巴^[12]，但临床上发现其长期使用会出现症状的波动及异动症^[13-14]。一些学者质疑外源性左旋多巴及其代谢产物可能会加速脑内氧化应激反应和促进线粒体功能失调，进而对黑质多巴胺神经元产生毒性作用，加速其凋亡和变性坏死^[15]，而左旋多巴是否能够通过其他途径产生氧化应激等作用机制，能够产生哪些行为学改变及病理改变是作者研究的目的。

在本实验中，通过各组的行为学改变可以发现，与对照组相比，小剂量左旋多巴[10 mg/(kg•d)]治疗组帕金森病大鼠各时点学习、记忆能力差异无显著性意义，但是随着左旋多巴应用时间延长、剂量增加，中剂量[20 mg/(kg•d)]、大剂量[30 mg/(kg•d)]左旋多巴治疗组帕金森病大鼠学习记忆能力相应降低，表明小剂量左旋多巴治疗对帕金森病大鼠的学习、记忆能力不产生明显影响，而左旋多巴神经毒性作用随其在动物体内聚积的剂量增加而逐渐增加，这与Jenner^[16]研究结果一致。左旋多巴神经毒性作用可能机制除了有自身氧化应激，其分解产物大量破坏DNA，从而导致中脑-边缘系统和中脑-皮质系统的多巴胺能神经元细胞凋亡或死亡；抑制细胞线粒体复合体Ⅰ^[17-18]，使线粒体膜脂质过氧化，损伤mtDNA^[19]，从而加重线粒体功能障碍，形成毒性循环之外，左旋多巴神经毒性作用可能机制是否还有其他的因素？

作者研究发现左旋多巴除了行为学上引起帕金森病大鼠学习记忆能力下降，还可进一步引起体内氨基酸的改变；与对照组相比，在各时点，小剂量左旋多巴[10 mg/(kg•d)]治疗组帕金森病大鼠同型半胱氨酸和叶酸水平差异无显著性意义；而随左旋多巴使用时间延长、剂量增加，中、大剂量左旋多巴治疗组帕金森病大鼠同型半胱氨酸水平相应升高，叶酸水平相应下降，这与王红梅等^[20]结果一致。左旋多巴引起同型半胱氨酸水平升高的机制是：左旋多巴的重要代谢途径之一是儿茶酚-氧位-甲基转移酶氧位甲基化分解为3-氧甲基多巴，这一过程中，腺昔蛋氨酸提供甲基并生成S-腺昔高半胱氨酸，后者迅速转化为同型半胱氨酸^[21]，而叶酸水平降低与代谢过程中消耗叶酸有关。同型半胱氨酸的毒性作用机制可能有：①促进兴奋性毒性及钙的细胞毒作用^[22]。②促进氧化应激^[23]。③促进能量消耗^[24-26]。④损伤线粒体功能^[27-28]。⑤加速细胞凋亡^[29]。

帕金森患者中有20%-40%可进展为严重的认知功能障碍——帕金森病性痴呆^[30-31]，从而使患者的预后进一步恶化。研究帕金森病性痴呆发生的危险因素对于帕金森病的治疗及患者的预后改善具有重要意义。目前研究表明高龄、发病年龄较晚、病程长、幻觉以及抑郁等均为帕金森病发生痴呆的危险因素^[32]，以视空间结构能力的下降、命名能力的下降及执行能力、记忆力、注意力、执行有计划性操作能力和思维敏感性的减退等为其主要临床症状^[33]。它除了导致患者残疾，还会加倍帕金森病的死亡风险并增加护理负担^[34]。目前研究提示帕金森病性痴呆患者的非多巴胺能神经通路如5-羟色胺、胆碱能通路、去甲肾上腺通路异常可能是认知和行为异常的原因之一^[35]。在帕金森病性痴呆患者的影像研究中发现胆碱能神经缺乏，这一变化较阿尔茨海默病患者严重，Merneyt核神经元减少，且与认知损害程度存在相关^[36]。

中枢胆碱能系统在学习、记忆、注意力等认知功能的调节中起关键作用^[37]，研究表明，海马的胆碱能系统直接参与信息的储存和回忆。乙酰胆碱酯酶是胆碱能神经元的标志酶，它与胆碱乙酰转移酶共同维持中枢神经系统重要的神经递质-乙酰胆碱的动态平衡，用乙酰胆碱酯酶活性可以反映胆碱能系统的功能。作者研究发现20 mg/(kg•d)及 30 mg/(kg•d)左旋多巴组各时间点乙酰胆碱酯酶活性较对照组减少；20 mg/(kg•d)左旋多巴组及30 mg/(kg•d)左旋多巴组中，第7天、第14天及第28天的乙酰胆碱酯酶活性较第1天显著降低，表明大鼠乙酰胆碱酯酶活性随左旋多巴用量增大、应用时间延长而明显下降，进一步说明左旋多巴对中枢胆碱能系统具有损害作用。

神经原纤维缠结是导致神经元纤维退化的主要原因，可作为大脑早老化的标志^[38]，目前认为神经原纤维缠结的形成与阿尔茨海默病患者的认知功能障碍呈明显的正相关^[39]。左旋多巴10 mg/(kg•d)组各时间点神经元排列整齐、密集，胞体呈圆球形，神经元未见拖尾且染色较深的轴突；与对照组比较差异无显著性意义 (P > 0.05)，而20 mg/(kg•d)组及30 mg/(kg•d)组各时间点神经元的形态有较大改变，神经元排列散乱，细胞内神经原纤维增粗，排列紊乱，可在CA1区见到较多胞体染色较深的神经元并呈拖尾状的深染的轴突斑块，形成神经原纤维缠结。因此得出结论，大鼠神经原纤维缠结样改变的神经元数量随左旋多巴剂量增大、应用时间增加而显著增多。

同型半胱氨酸的升高可以引起认知的缺损及痴呆，Allam等^[40]认为缺乏同型半胱氨酸的患者可以出现痴呆、精神障碍、共济失调。1例前瞻性研究表明，同型半胱氨酸对数值每增加1SD，痴呆的多变量——调整危险性为1.4。而当血浆同型半胱氨酸水平超过14 μmol/L时，老年性痴呆的危险性就几乎成倍增加^[41]。通过作者的研究表明，长时间、大剂量使用左旋多巴可使大鼠学习、记忆能力下降，乙酰胆碱酯酶活性下降，大鼠神经原纤维缠结样改变的神经元数量增多显著，其机制与同型半胱氨酸升高有关。同型半胱氨酸可能通过促进兴奋性毒性，促进氧化应激，损伤线粒体功能，增加DNA的损伤等多种机制促进海马和皮质神经元损伤，从而促进学习记忆能力下降。同型半胱氨酸引起大鼠行为学及病理学改变的机制有待进行下一步的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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帕金森病大鼠模型学习记忆能力与左旋多巴的关系

Relationship between learning and memory capacities and levodopa in rat models of Parkinson’s disease

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